Toward Precision Medicine in Atopic Dermatitis Using Molecular-Based Approaches / Hacia una medicina de precisión en la Dermatitis Atópica mediante el uso de enfoques moleculares

Atopic dermatitis is the most common chronic inflammatory skin disorder, affecting up to 20% of children and 10% of adults in developed countries. The pathophysiology of atopic dermatitis is complex and involves a strong genetic predisposition and T-cell driven inflammation. Although our understanding of the pathology and drivers of this disease has improved in recent years, there are still knowledge gaps in the immune pathways involved. Therefore, advances in new omics technologies in atopic dermatitis will play a key role in understanding the pathogenesis of this burden disease and could develop preventive strategies and personalized treatment strategies. In this review, we discuss the latest developments in genetics, transcriptomics, epigenomics, proteomics, and metagenomics and understand how integrating multiple omics datasets will identify potential biomarkers and uncover nets of associations between several molecular levels (AU)

La dermatitis atópica es el trastorno inflamatorio de la piel crónico más común. Afecta hasta a 20% de los niños y a 10% de los adultos en países desarrollados. La fisiopatología de la dermatitis atópica es compleja e implica una fuerte predisposición genética e inflamación impulsada por células T. Aunque nuestra comprensión de la patología y las causas de esta enfermedad ha mejorado en los últimos años, aún existen lagunas de conocimiento en las vías inmunológicas involucradas. En consecuencia, los avances en nuevas tecnologías ómicas en la dermatitis atópica desempeñarán un papel clave en la comprensión de la patogénesis de esta enfermedad y podrían desarrollar estrategias preventivas y tratamientos personalizados. En esta revisión se discuten los últimos avances en genética, transcriptómica, epigenómica, proteómica y metagenómica, y entendemos cómo la integración de múltiples conjuntos de datos ómicos identificará posibles biomarcadores y descubrirá redes de asociaciones entre varios niveles moleculares (AU)

[Artículo traducido] Hacia una medicina de precisión en la dermatitis atópica mediante el uso de enfoques moleculares / Toward Precision Medicine in Atopic Dermatitis Using Molecular-Based Approaches

La dermatitis atópica es el trastorno inflamatorio de la piel crónico más común. Afecta hasta a 20% de los niños y a 10% de los adultos en países desarrollados. La fisiopatología de la dermatitis atópica es compleja e implica una fuerte predisposición genética e inflamación impulsada por células T. Aunque nuestra comprensión de la patología y las causas de esta enfermedad ha mejorado en los últimos años, aún existen lagunas de conocimiento en las vías inmunológicas involucradas. En consecuencia, los avances en nuevas tecnologías ómicas en la dermatitis atópica desempeñarán un papel clave en la comprensión de la patogénesis de esta enfermedad y podrían desarrollar estrategias preventivas y tratamientos personalizados. En esta revisión se discuten los últimos avances en genética, transcriptómica, epigenómica, proteómica y metagenómica, y entendemos cómo la integración de múltiples conjuntos de datos ómicos identificará posibles biomarcadores y descubrirá redes de asociaciones entre varios niveles moleculares (AU)

Atopic dermatitis is the most common chronic inflammatory skin disorder, affecting up to 20% of children and 10% of adults in developed countries. The pathophysiology of atopic dermatitis is complex and involves a strong genetic predisposition and T-cell driven inflammation. Although our understanding of the pathology and drivers of this disease has improved in recent years, there are still knowledge gaps in the immune pathways involved. Therefore, advances in new omics technologies in atopic dermatitis will play a key role in understanding the pathogenesis of this burden disease and could develop preventive strategies and personalized treatment strategies. In this review, we discuss the latest developments in genetics, transcriptomics, epigenomics, proteomics, and metagenomics and understand how integrating multiple omics datasets will identify potential biomarkers and uncover nets of associations between several molecular levels (AU)

Toward Precision Medicine in Atopic Dermatitis Using Molecular-Based Approaches. / [Artículo traducido] Hacia una medicina de precisión en la dermatitis atópica mediante el uso de enfoques moleculares.

Atopic dermatitis is the most common chronic inflammatory skin disorder, affecting up to 20% of children and 10% of adults in developed countries. The pathophysiology of atopic dermatitis is complex and involves a strong genetic predisposition and T-cell driven inflammation. Although our understanding of the pathology and drivers of this disease has improved in recent years, there are still knowledge gaps in the immune pathways involved. Therefore, advances in new omics technologies in atopic dermatitis will play a key role in understanding the pathogenesis of this burden disease and could develop preventive strategies and personalized treatment strategies. In this review, we discuss the latest developments in genetics, transcriptomics, epigenomics, proteomics, and metagenomics and understand how integrating multiple omics datasets will identify potential biomarkers and uncover nets of associations between several molecular levels.

Toward Precision Medicine in Atopic Dermatitis Using Molecular-Based Approaches.

Atopic dermatitis is the most common chronic inflammatory skin disorder, affecting up to 20% of children and 10% of adults in developed countries. The pathophysiology of atopic dermatitis is complex and involves a strong genetic predisposition and T-cell driven inflammation. Although our understanding of the pathology and drivers of this disease has improved in recent years, there are still knowledge gaps in the immune pathways involved. Therefore, advances in new omics technologies in atopic dermatitis will play a key role in understanding the pathogenesis of this burden disease and could develop preventive strategies and personalized treatment strategies. In this review, we discuss the latest developments in genetics, transcriptomics, epigenomics, proteomics, and metagenomics and understand how integrating multiple omics datasets will identify potential biomarkers and uncover nets of associations between several molecular levels.

Respuesta biológica en las pacientes con cáncer de mama tratadas con radioterapia intraoperatoria / Biological response in breast cancer patients using intraoperative radiotherapy

Introducción: el tratamiento conservador de la mama junto con la radioterapia es de elección en las pacientes con cáncer de mama precoz. Gracias a un mayor conocimiento de la radiobiología tumoral, la tendencia actual consiste en utilizar técnicas de irradiación parcial acelerada, entre las que destaca la radioterapia intraoperatoria (RIO). Métodos: estudio prospectivo multicéntrico dividido en 2 grupos comparativos con casos consecutivos de las pacientes a que han recibido una cirugía conservadora por cáncer de mama asociada o no a RIO. Se valora la relación de esta terapia con los valores de las proteínas involucradas en la respuesta biológica (IL6, IL8, CXCL10, IL1β y TNF- α) en muestras de suero preoperatorio y a las 24 h desde la cirugía, y de drenaje quirúrgico a las 6 y 24 h desde la cirugía. Resultados: se ha objetivado en las pacientes tratadas con RIO una disminución significativa de IL6 e IL8, así como un aumento de CXCL10 favorable para la lucha contra la progresión del tumor (p valor < 0,05). Las alteraciones del sistema inmunológico se manifiestan tanto en suero como en débito del drenaje quirúrgico a las 6 y 24 h desde la cirugía. Conclusiones: la RIO modifica la respuesta biológica en las pacientes con cáncer de mama. A pesar de que se deben desarrollar más líneas de investigación, la comprensión de los mecanismos de desarrollo del tumor, abre una nueva etapa en el desarrollo de tratamientos perioperatorios dirigidos a dianas concretas que compensen las consecuencias dañinas de la cirugía. (AU)

Introduction: Breast conserving surgery with radiotherapy is the treatment of choice in patients with early breast cancer. Due to a better understanding of tumour radiobiology, the current trend is to use accelerated partial irradiation techniques, among which intraoperative radiotherapy (RIO) stands out. Methods: Prospective multicentre study divided into two comparative groups with consecutive cases of patients who have undergone conservative surgery for breast cancer associated or not with RIO. The relation of this therapy with the values of proteins involved in the biological response (IL6, IL8, CXCL10, IL1β y TNF- α) is assessed in serum samples preoperative and 24 hours after surgery, and surgical drainage samples at 6 and 24 hours after surgery. Results: A significant decrease in IL6 and IL8, as well as an increase in CXCL10 favourable for the fight against tumour progression (p-value < 0.05) was observed in patients treated with RIO. Immune system alterations are manifested in both serum and surgical drainage debit at 6 and 24 hours after surgery. Conclusions: RIO modifies the biological response in breast cancer patients. Although more lines of research need to be developed, the understanding of the mechanisms of tumour development opens a new stage in the development of perioperative treatments directed at specific targets that compensate for the harmful consequences of surgery. (AU)

Caracterização da secreção cutânea do anfíbio Trachycephalus nigromaculatus e investigação da atividade antimicrobiana

Trachycephalus nigromaculatus is a helmeted treefrog belonging to the Hylidae family, distinguished by its cranial apparatus adapted for phragmosis, a unique defense strategy. Its skin is notable for the abundance of poison glands, playing a crucial role in resistance against predators and pathogens in its natural habitat. However, the chemical composition of the venom and the effects of exposure to cutaneous secretion in humans and animals remain poorly understood. This study aimed to characterize the cutaneous secretion, assess its toxic effects, and explore the antimicrobial activity of Trachycephalus nigromaculatus secretion. We employed chromatographic analyses, SDS-PAGE gel electrophoresis, and mass spectrometry to identify the fractions of cutaneous secretion. The cell-inflammatory-epithelial interaction was examined through intravital microscopy, while the impact on cell viability was evaluated using the MTT assay. Antimicrobial activity was tested in vitro against S. aureus, S. coli, and C. albicans. Results revealed a complex mixture in T. nigromaculatus cutaneous secretion, with proteins ranging from 8.5 to 77 kDa. Noteworthy components include hyaluronidase, peroxiredoxin-6, and the toxin anntoxin. MALDI- TOF analysis indicated an abundant presence of peptides. Low concentrations (1μg/mL) of the secretion exhibited significant cytotoxic activity (76%) against VERO cells. In intravital microscopy, the secretion (3 μg and 30 μg) displayed relevant toxic activity, causing loss of elasticity, edema, infiltration, and hemorrhagic points, preventing the experiment's continuation after 2 hours of injection. Within 24 hours, signs of necrosis and infiltration were evident, accompanied by an increase in adhered and migrated cells. These effects were observed within just 5 minutes of topical application. Inhibition of microbial growth was observed in crude secretion against S. coli, S. aureus, and C. albicans. At least half of the fractions tested by HPLC exhibited relevant activity. Antimicrobial activity was particularly effective against gram-positive bacteria (S. aureus) and gram-negative bacteria (S. coli), demonstrating notable antifungal action against C. albicans. These results are significant as they represent the first description of the antimicrobial activity of T. nigromaculatus cutaneous secretion, highlighting substantial inhibition against fungi. Furthermore, this study provides the first detailed description of the biochemical content of cutaneous secretion, revealing a unique composition of compounds inducing notable toxic effects both in vivo and in vitro. These findings, coupled with the distinctive cranial apparatus of this species, reinforce its efficacy as an efficient defense mechanism.

Trachycephalus nigromaculatus é uma perereca-de-capacete da família Hylidae, destacada pelo seu aparelho craniano adaptado para a fragmose, uma estratégia de defesa peculiar. Sua pele é notória pela abundância de glândulas de veneno, desempenhando um papel crucial na resistência contra predadores e patógenos em seu habitat natural. No entanto, a composição química do veneno e os efeitos da exposição à secreção cutânea em humanos e animais permanecem pouco compreendidos. Este estudo objetivou caracterizar a secreção cutânea, avaliar seus efeitos tóxicos e explorar a atividade antimicrobiana da secreção de Trachycephalus nigromaculatus. Empregamos análises cromatográficas, eletroforese em gel SDS- PAGE e espectrometria de massa para identificar as frações da secreção cutânea. A interação célula-inflamatória-epitelial foi examinada por microscopia intravital, enquanto o impacto na viabilidade celular foi avaliado pelo ensaio MTT. A atividade antimicrobiana foi testada in vitro contra S. aureus, S. coli e C. albicans. Os resultados revelaram uma mistura complexa na secreção cutânea de T. nigromaculatus, com proteínas variando de 8,5 a 77 kDa. Destacam-se hialuronidase, peroxirredoxina-6 e a toxina anntoxina. A análise MALDI-TOF indicou uma presença abundante de peptídeos. Concentrações baixas (1μg/mL) da secreção apresentaram notável atividade citotóxica (76%) contra células VERO. Na microscopia intravital, a secreção (3 μg e 30 μg) exibiu atividade tóxica relevante, causando perda de elasticidade, edema, infiltração e pontos hemorrágicos, impedindo a continuidade após 2h de injeção. Em 24 horas, sinais de necrose e infiltração foram evidentes, juntamente com um aumento na contagem de células aderidas e migradas. Esses efeitos foram observados após apenas 5 minutos de aplicação tópica. Observou-se inibição do crescimento microbiano na secreção bruta para S. coli, S. aureus e C. albicans. Pelo menos metade das frações testadas por HPLC exibiram atividade relevante. A atividade antimicrobiana foi especialmente eficaz contra bactérias gram-positivas (S. aureus) e gram-negativas (S. coli), além de apresentar notável ação antifúngica contra C. albicans. Esses resultados são significativos, pois representam a primeira descrição da atividade antimicrobiana da secreção cutânea de T. nigromaculatus, destacando uma inibição importante contra fungos. Além disso, este estudo oferece a primeira descrição detalhada do conteúdo bioquímico da secreção cutânea, revelando uma composição singular de compostos que induzem efeitos tóxicos notáveis tanto in vivo quanto in vitro. Essas descobertas, aliadas ao distintivo aparelho ósseo na cabeça desta espécie, reforçam sua eficácia como uma eficiente arma de defesa.

Estudio proteomico diferencial entre liquidos pleurales secundarios a cáncer de pulmón versus mesotelioma / Differential proteomic study between pleural fluid secondary to lung cancer versus mesothelioma

Objetivo: Encontrar perfiles proteicos en líquido pleural que diferencien derrames pleurales secundarios a cáncer de pulmón (CP) versus mesotelioma pleural maligno (MPM).Metodología: Recogimos líquidos pleurales de 60 pacientes de tres grupos diferentes: MPM (N = 20), CP (N = 20) y derrames pleurales benignos (N = 20). Realizamos un análisis con proteómica diferencial con ITRAQ 4 plex (Applied Biosystem). Realizamos la identificación y cuantificación relativa de las proteínas con el programa Proteome Discoverer 1.4 (Termofisher Scientific). Construimos diagramas de Venn con las proteínas sobre/infra-expresadas en cada grupo. Realizamos una validación interna/externa mediante ELISA (Myobiosorce) añadiendo 25 muestras de CP y 14 de MPM.Resultados: Encontramos sobreexpresión de Pi3K en los derrames pleurales neoplásicos (16,86 +/- 25,83 ng/ml en CP; 20,66 +/- 17,26 ng/ml en MPM vs 5,92 +/- 0,99 ng/ml en controles). Hubo sobreexpresión de SPRM en MPM (30.702 +/- 30.310,53 ng/ml en el grupo MPM vs 10.404 +/- 10.157,72 ng/ml en el grupo CP vs 8.498 + /- 3.437,18 ng/ml en controles). Existió sobreexpresión de RhoB en CP (4,46 +/- 1,65 mg/ml en CP vs 1,65 +/- 2,65 mg/ml en MPM vs 0,92 +/- 1,6 mg/ml en controles). También encontramos sobreexpresión de PDGFR-alfa en derrames pleurales benignos (74,12 +/- 22,57 ng/ml en controles vs 43,05 +/- 23,96 ng/ml en CP vs 36,12 +/- 21,51 ng/ml en MPM).Conclusión: Existe un perfil diferencial proteico entre los derrames secundarios a CP (sobreexpresión de RhoB) y a MPM (sobrexpresión de SPRM). La sobrexpresión de Pi3K indica asociación a derrames pleurales malignos y la de PDGFR-alfa a derrames benignos. (AU)

Objetivo: Find protein profiles in pleural fluid that differentiate pleural effusions secondary to lung cancer (LC) versus malignant pleural mesothelioma (MPM).Metodología: We collected pleural fluids from 60 patients from three different groups: MPM (N = 20), CP (N = 20), and benign pleural effusions (N = 20). We performed differential proteomics analysis with ITRAQ 4 plex (Applied Biosystem). We performed the identification and relative quantification of the proteins with the Proteome Discoverer 1.4 program (Termofisher Scientific). We built Venn diagrams with the over/under-expressed proteins in each group. We performed an internal/external validation using ELISA (Myobiosorce) adding 25 CP and 14 MPM samples.Resultados: We found Pi3K overexpression in neoplastic pleural effusions (16.86 +/- 25.83 ng/ml in PC; 20.66 +/- 17.26 ng/ml in MPM vs 5.92 +/- 0.99 ng/ml in controls). There was overexpression of SPRM in MPM (30,702 +/- 30,310.53 ng/ml in the MPM group vs 10,404 +/- 10,157.72 ng/ml in the CP group vs 8,498 +/- 3,437.18 ng/ml in controls). There was overexpression of RhoB in CP (4.46 +/- 1.65 mg/ml in CP vs 1.65 +/- 2.65 mg/ml in MPM vs 0.92 +/- 1.6 mg/ml in controls). We also found overexpression of PDGFR-alpha in benign pleural effusions (74.12 +/- 22.57 ng/ml in controls vs 43.05 +/- 23.96 ng/ml in PC vs 36.12 +/- 21.51 ng/ml in MPM ).Conclusión: There is a differential protein profile between effusions secondary to CP (RhoB overexpression) and MPM (SPRM overexpression). Pi3K overexpression indicates association with malignant pleural effusions and PDGFR-alpha overexpression with benign effusions. (AU)

Identification of proteins that allow to distinguish subjects with and without Recurrent Aphthous Stomatitis / IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS QUE PERMITAN DISTINGUIR SUJETOS CON Y SIN ESTOMATITIS AFTOSA RECURRENTE

Recurrent aphthous stomatitis (RAS) is the most common ulcerative disease of the oral mucosa. Currently, the therapeutic alternatives are only palliative and limited, due to a poor understanding of the etiopathogenic process. The objective of this study is to identify proteins that allow distinguishing between groups of subjects with and without Recurrent Aphthous Stomatitis, to understand the processes that control health and disease states. In this case-control study, we evaluated by means of proteomics based on mass spectrometry the saliva of healthy controls and patients with recurrent aphthous stomatitis during the presence and absence of lesions. We quantified the proteins, using the spectral counts reported by PEAKS Studio X+, and we prepared a database using SPSS statistics. We determined the differentially expressed proteins between the conditions with Perseus software using ANOVA analysis and hierarchical clustering. The salivary cyclic AMP-dependent transcription factor protein ATF-6 beta (ATF6B), stands out with a better classification profile. Hence, its presence allows us to distinguish between the presence and absence of ulcerative lesions in patients with and without recurrent aphthous stomatitis. Our analysis revealed that ATF6B is related to the endoplasmic reticulum stress response in oral keratinocytes. From a clinical perspective, we suggest that this protein is connected to several biological processes, mainly related to an anti-cell death response, determined by the stress of the endoplasmic reticulum, which could cause the damage that results in the release of this marker into the oral environment.

La estomatitis aftosa recurrente es la enfermedad más común de la mucosa oral. Actualmente las alternativas terapéuticas son sólo paliativas y limitadas, debido a la escasa comprensión del proceso etiopatogénico. El objetivo de este estudio es identificar proteínas que permitan distinguir entre grupos de sujetos con y sin estomatitis aftosa recurrente, para comprender los procesos que controlan los estados de salud y enfermedad. En este estudio de casos y controles, evaluamos mediante proteómica basada en espectrometría de masas la saliva de controles sanos y pacientes con estomatitis aftosa recurrente durante la presencia y ausencia de lesiones. Cuantificamos las proteínas, utilizando los recuentos espectrales informados por PEAKS Studio X+, y preparamos una base de datos utilizando SPSS. Determinamos las proteínas expresadas diferencialmente entre los grupos con el software Perseus mediante un análisis de ANOVA y un agrupamiento jerárquico. La proteína factor de transcripción dependiente de AMP cíclico salival ATF-6 beta (ATF6B), destaca con un mejor perfil de clasificación, por lo que su presencia permite distinguir entre la presencia y ausencia de lesiones ulcerosas en pacientes con y sin estomatitis aftosa recurrente. Nuestro análisis reveló que ATF6B está relacionada con la respuesta al estrés del retículo endoplásmico en los queratinocitos orales. Desde una perspectiva clínica, sugerimos que esta proteína está relacionada con varios procesos biológicos principalmente referentes con una respuesta anti-muerte celular, determinada por el estrés del retículo endoplásmico que podría ser la causa del daño que resulta en la liberación de este marcador al medio oral.

Identificación rápida de micobacterias no tuberculosas mediante técnicas proteómicas (MALDI-TOF) / A rapid proteomic system (MALDI-TOF) for nontuberculous-mycobacteria identification

La identificación proteómica de micobacterias no tuberculosas (MNTs) mediante MALDI-TOF presenta una mayor complejidad debido a la especial composición de su pared celular, que complica la extracción de proteínas. Un total de 106 aislamientos pertenecientes a diferentes especies de MNTs procedentes de muestras clínicas del Complejo Asistencial Universitario de León recogidas durante los años 2019 y 2020 se han identificado por un método proteómico abreviado (MALDI-TOF Biotyper Bruker®) desarrollado en nuestro laboratorio. La identificación se ha comparado con la realizada en paralelo en el Centro de Referencia de Majadahonda. Se analizaron un total de 22 especies diferentes de MNTs obteniendo una concordancia del 91,5%. Las nueve discrepancias detectadas se dieron entre especies pertenecientes al mismo grupo taxonómico. En el 67,92% de las identificaciones el score fue superior a 1,8. En el tiempo de procesamiento se obtuvo un ahorro aproximado de 24 minutos con respecto al recomendado por el fabricante.(AU)

Proteomic techniques relaying upon mass spectrometry (MALDI_TOF) applied to nontuberculous mycobacteria (NTM) identification, constitute a difficult goal. Cell wall structure features complicates the protein extraction procedure. A total of 106 isolates belonging to a variety of MNTs species isolated from clinical samples taken at the Complejo Asistencial Universitario de León for a two years period (2019-20) were identified following a simplified method (MALDI-TOF Biotyper Bruker®) developped in our laboratory. The resultant identification was compared to a parallel one ruled on the Centro de Referencia de Majadahonda. A total of 22 different MNTs species were tested, obtaining an agreement of 91,5%. Only 9 minor discrepancies between species belonging to the same taxonomic group of MNTs were detected. The score obtained in the 67.92% of the cases was higher than 1.8. A time-saving of 24 minutes compared to the manufacturer‘s proceeding was achieved.(AU)

A rapid proteomic system (MALDI-TOF) for nontuberculous-mycobacteria identification.

Proteomic techniques relaying upon mass spectrometry (MALDI_TOF) applied to nontuberculous mycobacteria (NTM) identification, constitute a difficult goal. Cell wall structure features complicates the protein extraction procedure. A total of 106 isolates belonging to a variety of MNTs species isolated from clinical samples taken at the Complejo Asistencial Universitario de León for a two years period (2019-20) were identified following a simplified method (MALDI-TOF Biotyper Bruker®) developped in our laboratory. The resultant identification was compared to a parallel one ruled on the Centro de Referencia de Majadahonda. A total of 22different MNTs species were tested, obtaining an agreement of 92,45%. Only 8 minor discrepancies between species belonging to same taxonomic group of MNTs were detected. The score obtained in the 67.92% of the cases was higher than 1.8. A time-saving of 24min compared to the manufacturer's proceeding was achieved.

Identificação de moduladores da sinalização celular no câncer de cólon e metástases hepáticas como ferramenta para descoberta de alvos terapêuticos / Identification of cell signaling modulators in colon cancer and liver metastases as a tool for discovering therapeutic targets

O câncer de cólon é uma das principais causas de morte por câncer em todo mundo e aproximadamente 50% dos pacientes desenvolvem metástases hepáticas durante o curso da doença. Ainda que a ressecção cirúrgica proporcione sobrevida de 5 anos ao redor de 40%, a maior parte dos pacientes apresenta doença irressecável ao diagnóstico. Neste caso, o cenário é devastador devido à resistência das células tumorais ao tratamento padrão com quimioterapia e/ou anticorpo monoclonal. Apesar dos avanços alcançados pelo rastreamento genômico das metástases, o conhecimento sobre o envolvimento de transcritos e proteínas específicas na atividade de sinalização e recrutamento de populações imunes ainda é limitado nessa doença. Considerando o grande potencial de descoberta e inovação que pode ser alcançado, este projeto propôs o desenvolvimento de uma meta-análise de dados públicos para a exploração de metástases hepáticas e a caracterização proteômica de metástases hepáticas inicialmente irressecáveis em busca de alvos promissores que possam ser explorados em novas opções terapêuticas. As principais etapas metodológicas incluem (1) desenvolvimento de um modelo de integração de dados para a obtenção, processamento e análise de aproximadamente 3.5 mil amostras de RNA-seq, microarray e proteômica de metástases hepáticas inicialmente ressecáveis, tumores primários do cólon e tecidos não-neoplásicos, (2) rastreamento por espectrometria de massas de 30 biópsias pareadas, sendo 15 de metástases hepáticas inicialmente irressecáveis e 15 de tecidos não-neoplásicos adjacentes, (3) investigação de potenciais moduladores da sinalização oncogênica associada à resistência à terapia e (4) exploração dos resultados em um conjunto independente com aproximadamente 138 mil células obtidas por single-cell RNA-seq em busca de associações entre alvos, vias de sinalização e populações imunes. Após a análise de espectrometria de massas e integração de dados da metaanálise, das 46 proteínas diferencialmente reguladas entre metástases hepáticas inicialmente irressecáveis e tecidos não-neoplásicos, TGFB1, CDH2, APOA1, TNFR2, EGFR, MDH2, ITIH2, YWHAZ, PCBP1, TOP2A e ENO1 (todas com aumento de regulação nas metástases) e CXCL14, PLA2G2A e CAV1 (com diminuição de regulação nas metástases) prosseguiram na análise. Dessas, PLA2G2A e CAV1 não foram estatisticamente confirmadas após comparação com cinco estudos independentes. Também foi identificada a ativação nas metástases de importantes vias como JAK-STAT (z-score=3,18), VEGF (z-score=2,67), WNT (z-score=3,22), PI3K (z-score=3,99), MAPK (z-score=2,85), EGFR (z-score=2,49) e NFkB (zscore=4,11). Em seguida observamos pela análise de single-cell RNA-seq que a presença de TGFB1, TNFR2 e EGFR estava associada a maior polarização de neutrófilos e células Tregs em metástases hepáticas, sugerindo uma participação desses alvos no recrutamento dessas populações imunes ou em conjunto durante o desenvolvimento, estabelecimento dessas células no fígado e progressão da doença. Tanto TGFB1 (p=0,01) quanto TNFR2 (p=0,048) foram associados a pior sobrevida global em pacientes metastáticos e apresentaram AUC=0,95 na separação entre câncer primário no cólon e metástases no fígado. Especificamente sobre a comparação entre metástases inicialmente ressecáveis e irressecáveis, apesar de termos identificado alguns alvos com mais de 10-fold de diferença (YWHAZ, AHNAK, HNRNPH1, PCBP1 e TGFB1) apenas TGFB1 prosseguiu em todas as análises, porém, esses resultados sugerem a exploração posterior desses candidatos em novos estudos. Quando buscamos por alvos relacionados à resistência à terapia, nossa estratégia selecionou 32 proteínas diferencialmente reguladas nas metástases resistentes, com envolvimento de CDH2 (p=0,002), CXCL14 (p=0,05), SERPINA1 (p=0,012) e LRGR (p=0,049) com pior sobrevida global em pacientes metastáticos. Nesses tumores também foi observada uma tendência de ativação das vias TGF-ß e TNF-α, já descritas na literatura devido a participação no desenvolvimento e progressão de metástases, além de favorer um perfil de resistência às células tumorais. Por meio de uma análise de deconvolução também observamos maior presença de células Tregs em pacientes resistentes. Essa relação entre Tregs/LGR5 também já foi associada a pior prognóstico em outros tipos de cânceres e suportam uma participação de ambos em um possível mecanismo de resistência desses tumores. Com base nos resultados obtidos, acreditamos oferecer um conjunto de dados inéditos que podem modificar o prognóstico e diagnóstico das metástases hepáticas, bem como contribuir para que os pacientes tenham novas opções terapêuticas com melhora na sobrevida

Colon cancer is one of the leading causes of cancer death worldwide and approximately 50% of patients develop liver metastases during the course of the disease. Although surgical resection provides a 5-year survival rate of around 40%, most patients have unresectable disease at diagnosis. In this case, the scenario is devastating due to the resistance of tumor cells to standard treatment with chemotherapy and/or monoclonal antibody. Despite the advances achieved by genomic tracking of metastases, the involvement of specific transcripts and proteins in the signaling activity and recruitment of immune populations is still limited in this disease. Considering the great potential for discovery and innovation that can be achieved, this project proposed the development of a meta-analysis for the exploration of liver metastases and the proteomic characterization of initially unresectable liver metastases in search of promising targets that can be explored in new therapeutics options. Key methodological steps include (1) development of a data integration model for obtaining, processing and analyzing approximately 3,500 RNA-seq, microarray and proteomic samples from initially resectable liver metastases, primary colon tumors and non-neoplastic tissues, (2) mass spectrometry screening of 30 paired biopsies, 15 from initially unresectable liver metastases and 15 from adjacent non-neoplastic tissues, (3) investigation of potential modulators of oncogenic signaling associated with therapy resistance, and (4) exploration of the results in an independent pool of approximately 138,000 cells obtained by single-cell RNA-seq in search of associations between targets, signaling pathways and immune populations. After mass spectrometry analysis and integration of metaanalysis data, of the 46 differentially regulated proteins between initially unresectable liver metastases and non-neoplastic tissues, TGFB1, CDH2, APOA1, TNFR2, EGFR, MDH2, ITIH2, YWHAZ, PCBP1, TOP2A and ENO1 (all with upregulation in metastases) and CXCL14, PLA2G2A and CAV1 (with downregulation in metastases) continued in the analysis. Of these, PLA2G2A and CAV1 were not statistically confirmed after comparison with five independent studies. We identified activation of important pathways such as JAK-STAT (zscore=3.18), VEGF (z-score=2.67), WNT (z-score=3.22), PI3K (z-score=3.99), MAPK (z- score=2.85), EGFR (z-score=2.49) and NFkB (z-score=4.11). Then we observed by single-cell RNA-seq analysis that the presence of TGFB1, TNFR2 and EGFR was associated with greater polarization of neutrophils and Treg cells in liver metastases, suggesting a participation of these targets in the recruitment of these immune populations or together during development, establishment of these cells in the liver and disease progression. Both TGFB1 (p=0.01) and TNFR2 (p=0.048) were associated with worse overall survival in patients with metastatic disease and had AUC=0.95 separating primary colon cancer from liver metastases. Specifically, regarding the comparison between initially resectable and unresectable metastases, although we identified some targets with more than 10-fold difference (YWHAZ, AHNAK, HNRNPH1, PCBP1 and TGFB1) only TGFB1 continued in all analyses, however, these results suggest the exploration of these candidates in further studies. When looking for targets related to therapy resistance, our strategy selected 32 proteins differentially regulated in resistant metastases, with involvement of CDH2 (p=0.002), CXCL14 (p=0.05), SERPINA1 (p=0.012) and LRGR (p=0.049) with poor overall survival in metastatic patients. In these tumors, a tendency of activation of the TGF-ß and TNF-α pathways was also observed, already described in the literature due to their participation in the development and progression of metastases, in addition to favoring a resistance profile to tumor cells. By means of a deconvolution analysis, we also observed a greater presence of Treg cells in resistant patients. This relationship between Tregs/LGR5 has also been associated with a worse prognosis in other types of cancers and supports the participation of both in a possible mechanism of resistance in these tumors. Based on the results obtained, we believe to offer a set of unpublished data that can modify the prognosis and diagnosis of liver metastases, as well as contribute to patients having new therapeutic options with improved survival

Proteomics: a tool to investigate of composition and function of HDL in hyperlipidemia / Proteômica: uma ferramenta para a investigação da composição e função da HDL em hiperlipidemia

The inverse relationship between HDL-C (high-density lipoprotein cholesterol) and cardiovascular disease is well established. However, it is consensus that the cholesterol content present in HDL does not capture its complexity, and other metrics need to be explored. HDL is a heterogeneous, protein-enriched particle with functions going beyond lipid metabolism. In this way, its protein content seems to be attractive to investigate its behavior in the face of pathologies. Many of the proteins with important function in HDL are in low abundance (<1% of total proteins), which makes their detection challenging. Quantitative proteomics allows detecting proteins with high precision and robustness in complex matrix. However, quantitative proteomics is still poorly explored in the context of HDL. In this sense, in the second chapter of this thesis, the analytical performance of two quantitative methodologies was carefully investigated. These methods achieved adequate linearity and high precision using labeled peptides in a pool HDL, in addition to comparable ability to differentiate proteins from HDL subclasses of healthy subjects. Another bottleneck that waits for a solution in proteomics is the lack of standardization in data processing and analysis after mass spectrometry acquisition. In addition, interest in the cardioprotective properties of omega-3 is growing, but little is known about its effects on the HDL proteome. Thus, in the third chapter of this thesis, we compared five protein quantification strategies using Skyline and MaxDIA software platforms in order to investigate the HDL proteome from mice submitted to a high-fat diet supplemented or not with omega-3. MaxDIA with label-free quantification (MaxLFQ) achieved high precision to show that polyunsaturated fatty acids remodel the HDL proteome to a less inflammatory profile. Therefore, the two studies presented in this thesis begin to open new paths for a deeper and more reliable understanding of HDL, both at the level of protein quantification by mass spectrometry and after data acquisition

A inversa relação entre HDL-C (do inglês, high-density lipoprotein cholesterol) e doenças cardiovasculares é bem estabelecida. No entanto, é consenso que o conteúdo de colesterol presente na HDL não captura sua complexidade, e outras métricas precisam ser exploradas. A HDL é uma partícula heterogênea, enriquecida em proteínas, com funções que vão além do metabolismo de lipídeos. Dessa forma, seu conteúdo proteico parece ser mais atrativo para exprimir seu comportamento frente às patologias. Muitas das proteínas com função importante estão em baixa abundância (<1% do total de proteínas), o que torna a detecção desafiadora. Métodos quantitativos de proteômica permitem detectar proteínas com alta precisão e robustez em matrizes complexas. No entanto, a proteômica quantitativa ainda é pouco explorada no contexto da HDL. Nesse sentido, no segundo capítulo dessa tese, a performance analítica de dois métodos quantitativos foi criteriosamente investigada, os quais alcançaram adequada linearidade e alta precisão usando peptídeos marcados em um pool de HDL, além de comparável habilidade em diferenciar as proteínas das subclasses da HDL de indivíduos saudáveis. Outro gargalo que aguarda por solução em proteômica é a falta de padronização no processamento e análise de dados após a aquisição por espectrometria de massas. Além disso, é crescente o interesse das propriedades cardioprotetivas do ômega-3, porém pouco se conhece sobre seus efeitos no proteoma da HDL. Então, no terceiro capítulo dessa tese, comparamos cinco estratégias de quantificação de proteínas utilizando os softwares Skyline e MaxDIA com o intuito de comparar o proteoma da HDL de camundongos submetidos a uma dieta hiperlipídica suplementados ou não com ômega-3. MaxDIA com quantificação label-free (MaxLFQ) apresentou alta precisão para mostrar que o ômega-3 remodela o proteoma da HDL para um perfil menos inflamatório. Portanto, os dois estudos apresentados nessa tesa começam a abrir novos caminhos para o entendimento mais profundo e confiável da HDL tanto por meio da quantificação das proteínas por espectrometria de massas quanto após à aquisição dos dados

Identificação e caracterização bioquímica de inibidores de serinopeptidases isolados a partir da peçonha das anêmonas-do-mar Anthopleura cascaia e Aulactinia veratra

Phylum Cnidaria comprises more than 10,000 species and around 10% of them are represented by sea anemones. These animals are underexplored sources of molecules, possessing structurally diverse toxins that can act over a diverse range of pharmacological targets, including enzymes. Sea anemones represent almost 96% of the manually annotated toxins from the phylum, but until now only 5% of its species have been studied about their toxin content. In the present work, the venoms of the sea anemones Anthopleura cascaia and Aulactinia veratra were studied and accessed through mass spectrometry analysis for searching serine peptidase inhibitors. The arsenal of toxins from both venoms was elucidated. Additionally, venom’s fractions were screened for inhibitory activity over trypsin, using time-course fluorescence-based kinetic assays or Mass spectrometry-based analysis. Beyond that, the spatial distribution of serine peptidase inhibitors in both sea anemones’ tissues were shown through Mass Spectrometry Imaging by MALDITOF. In the analysis of toxins composition, it was seen that A. cascaia venom presents at least three types of toxins: cytolysins, phospholipases and a toxin similar to natterin. For A. veratra, the classification based on blastp hit similarity and relying on domain architecture of the toxin’s sequences (translated transcripts) was performed. The thorough examination over toxins sequences led to the identification of 59 proteins and peptides belonging to 14 known toxin’s families of sea anemones and to the acknowledge of 20 peptides presenting 18 new cysteine scaffolds. The venom of this sea anemone mainly relies on neurotoxins from ShK-like, β-defensins, SCRiP, ICK, EGF-like types and on serine peptidase inhibitors from Kazal and Kunitz types. Furthermore, serine peptidase inhibitors from both venoms were isolated and present main distribution over tentacles, mesenterial filaments and pedal disc of these sea anemones, suggesting the preferential stock of these toxins. In conclusion, the methodological approaches applied in this study were able of identifying the presence of serine peptidase inhibitors on the venom and tissue of sea anemones through chromatographic techniques followed by enzymatic assays, and MALDI-Imaging.

O filo Cnidaria é composto por mais de 10.000 espécies e cerca de 10% destas são anêmonas-do-mar. Estes animais são considerados fontes subexploradas de moléculas, possuindo um diverso arsenal de toxinas que podem agir sobre diferentes alvos farmacológicos, incluindo enzimas. Toxinas de anêmonas-do-mar representam cerca de 96% das toxinas anotadas para o filo Cnidaria, embora apenas 5% de suas espécies tenham sido estudadas quanto à composição de toxinas até o momento. Neste trabalho elucidamos por espectrometria de massas a composição da peçonha das anêmonas Anthopleura cascaia e Aulactinia veratra, buscando a identificação de inibidores de serinopeptidases. O arsenal de toxinas para ambas anêmonas foi elucidado. Ainda, descrevemos as etapas de purificação envolvidas na busca de inibidores e a seleção destes candidatos por meio da inibição da atividade da tripsina, avaliada por duas técnicas distintas։ Cinética enzimática e Espectrometria de massas. Adicionalmente, descrevemos a localização de candidatos a inibidores no tecido das anêmonas através do Imageamento por espectrometria de massas. Na análise sobre a composição de toxinas destas anêmonas, vimos que a peçonha da A. cascaia apresentou a existência três tipos de toxinas incluindo citolisinas, fosfolipases e naterinas. Para a espécie A. veratra, a classificação de toxinas baseadas no blastp hit e na arquitetura de domínios das toxinas foi realizada. Esta análise revelou a presença de 59 proteínas e peptídeos pertencentes a 14 famílias de toxinas de anêmonasdo-mar; além do reconhecimento de 20 peptídeos apresentando 18 novos scaffolds de cisteínas. A peçonha desta anêmona é principalmente composto por neurotoxinas do tipo ShK-like, β-defensinas, SCRiP, ICK, EGF-like e inibidores de serinopeptidases. Os dados obtidos mostram que ambas anêmonas são ricas fontes de inibidores de serinopeptidases, especialmente tipo Kunitz e Kazal. Tais inibidores apresentam distribuição na região dos tentáculos, mesentério e disco pedal das anêmonas, o que pode indicar o estoque preferencial destas toxinas. E conclusão, o conjunto de abordagens metodológicas empregadas neste trabalho foi capaz de atender os objetivos propostos: identificar a presença de inibidores de serinopeptidases na peçonha e tecido de anêmonas, tanto por fracionamento cromatográfico seguido de ensaio enzimático, quanto por MALDI-Imaging.

Proteomic analysis identifies molecular players and biological processes specific to SARS-CoV-2 exposure in endothelial cells

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has been responsible for the severe pandemic of acute respiratory disease, coronavirus disease 2019 (COVID-19), experienced in the 21st century. The clinical manifestations range from mild symptoms to abnormal blood coagulation and severe respiratory failure. In severe cases, COVID-19 manifests as a thromboinflammatory disease. Damage to the vascular compartment caused by SARS-CoV-2 has been linked to thrombosis, triggered by an enhanced immune response. The molecular mechanisms underlying endothelial activation have not been fully elucidated. We aimed to identify the proteins correlated to the molecular response of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) after exposure to SARS-CoV-2, which might help to unravel the molecular mechanisms of endothelium activation in COVID-19. In this direction, we exposed HUVECs to SARS-CoV-2 and analyzed the expression of specific cellular receptors, and changes in the proteome of HUVECs at different time points. We identified that HUVECs exhibit non-productive infection without cytopathic effects, in addition to the lack of expression of specific cell receptors known to be essential for SARS-CoV-2 entry into cells. We highlighted the enrichment of the protein SUMOylation pathway and the increase in SUMO2, which was confirmed by orthogonal assays. In conclusion, proteomic analysis revealed that the exposure to SARS-CoV-2 induced oxidative stress and changes in protein abundance and pathways enrichment that resembled endothelial dysfunction.

Isolamento e caracterização das toxinas causadoras de priapismo do veneno do escorpião Leiurus quinquestriatus

Scorpionism is considered a serious public health issue around the world. One of the most important species is the Leiurus quinquestriatus, popularly known as `Death seeker`. It is predominantly found in the Saara and the Arabic peninsula. Its venom causes autonomic reactions as blood pressure oscillations, hypersalivation. Priapism is frequently associated to this scorpion sting. Considering the importance of this issue, the primary objective of this study is to isolate and characterize the toxin(s) involved in priapism present in this venom. Crude desiccated venom was obtained from a qualified commercial supplier. The activity-driven purification strategy was employed in which RP-HPLC steps were developed in order to achieve the highest purity of a fraction capable of inducing priapism in mice. We successfully isolated a fraction named 10C, composed by isoforms. The fraction was further analyzed by MALDI-TOF and ESI-IT- TOF/MS after reduction, alkylation and trypsin digestion and yielded a predominant molecular mass of 7230Da. Comparing the partial sequences in public databases for toxins, we identified similarities with eight toxins: Alpha-insect toxin (Lqq3), Alpha-toxin (Lqq4); Alpha-like toxin (Lqh6); Alpha-mammal toxin (Lqq5); Alpha-like toxin (Lqh3); Alpha-mammal toxin (Lqh2); Neurotoxin 2; Neurotoxin h3.1. The fraction 10C seems to produce fewer side effects as hypersalivation and death than other priapism-inducing toxins isolated from spiders previously studied by our group. Next steps include the complete proteomics of the L. quinquestriatus venom, as well as the identification of the target of these toxins by affinity chromatography and other methods.

O escorpionismo é considerado como um grave problema de saúde pública mundial, considerada uma das espécies mais venenosa, Leiurus quinquestriatus, conhecido popularmente como o perseguidor da morte, encontrada principalmente na região do Saara e a Península Árabe, seu veneno causa manifestações sistêmicas como consequência da hiperativação do sistema nervoso autônomo, levando à sintomas como o priapismo, um efeito incomum à picada do escorpião. O priapismo tem sido descrito com frequência em casos de acidentes por este escorpião. Tendo em vista a relevância desse tema, o objetivo deste trabalho é purificar e isolar o peptídeo responsável por causar o priapismo presente em seu veneno. O veneno bruto dessecado foi adquirido de fornecedor comercial qualificado. As etapas de purificação foram desenvolvidas empregando-se o HPLC em coluna de fase reversa. Foi usada a estratégia de purificação acompanhada de atividade, na qual as frações de veneno obtidas em cada etapa eram testadas quanto a ação do priapismo. Com esta estratégia conseguimos isolar uma fração que se denominou 10C. A fração foi analisada por espectrometria de massa MALDI-TOF e ESI-IT-TOF/MS. Foi encontrado para o pico 10C a massa molecular predominante de 7230Da. A avaliação das sequencias de amino ácidos obtidos após redução e digestão parcial, em comparação contra bases de dados de toxinas mostrou similaridade com oito peptídeos, a saber: Alpha-insect toxin (Lqq3), Alpha-toxin (Lqq4); Alpha-like toxin (Lqh6); Alpha-mammal toxin (Lqq5); Alpha-like toxin (Lqh3); Alpha-mammal toxin (Lqh2); Neurotoxin 2; Neurotoxin h3.1. Os testes em animais sugerem que haja menos efeitos secundários como hipersalivação e morte. Nos próximos passos será realizado o estudo proteômico do veneno bruto e a análise de receptores para esta classe de toxinas com a utilização de técnicas de cromatografia de afinidade.

Proteomic analysis of human keratinocytes under UVA-induced stress / Análise proteômica de queratinócitos humanos sob estresse induzido por luz UVA

The solar ultraviolet (UV) radiation that reaches the Earth is composed of 95% of UVA (320 to 400 nm) and 5% of UVB (280 to 320 nm) radiation. UVB is carcinogenic, generating potentially mutagenic DNA lesions. The solar UVA radiation also causes DNA damage, but this fact does not fully account for its biological impact. UVA is absorbed by non-DNA cellular chromophores, generating reactive oxygen species such as singlet oxygen. Knowing the proteome mediates stress responses in cells, here we investigated the cellular effects of a non-cytotoxic dose of UVA radiation, equivalent to about 20 minutes of midday sun exposure, on the proteome of human keratinocytes. Using a combination of mass spectrometry-based proteomics, bioinformatics, and conventional biochemical assays, we analyzed two aspects of UVA-induced stress: spatial remodeling of the proteome in subcellular compartments 30 minutes after stress and long-term changes in protein levels and secretion (24 hours and 7 days postirradiation). In the first part of this thesis, we quantified and assigned subcellular localization for over 3000 proteins, of which about 600 potentially redistribute upon UVA exposure. Protein redistributions were accompanied by redox modulations, mitochondrial fragmentation and DNA damage. In the second part of the work, our results showed that primary human keratinocytes enter senescence upon exposure to a single dose of UVA, mounting antioxidant and inflammatory responses. Cells under UVA-induced senescence further elicit paracrine responses in neighboring premalignant HaCaT epithelial cells via inflammatory mediators. Altogether, these results reiterate the role of UVA radiation as a potent metabolic stressor in the skin

A radiação ultravioleta (UV) solar que atinge a superfície terrestre é composta por 95% de radiação UVA (320 a 400 nm) e 5% de radiação UVB (280 a 320 nm). A radiação UVB é carcinogênica e gera lesões potencialmente mutagênicas no DNA. A radiação UVA solar também gera danos no DNA, mas a genotoxicidade dessa radiação não explica inteiramente o seu impacto biológico. Atualmente, sabe-se que a radiação UVA é absorvida por cromóforos celulares, gerando espécies reativas de oxigênio, como o oxigênio singlete. Sabendo que o proteoma é um mediador de respostas ao estresse celular, nós investigamos os efeitos celulares de uma dose não-citotóxica de radiação UVA, equivalente a cerca de 20 minutos de exposição ao sol, no proteoma de queratinócitos humanos. Utilizando espectrometria de massas, bioinformática e ensaios bioquímicos convencionais, nós analisamos dois aspectos do estresse induzido por radiação UVA: o remodelamento espacial do proteoma 30 minutos depois do estresse e alterações nos níveis e na secreção de proteínas no longo prazo (24 horas e 7 dias depois da irradiação). Na primeira parte desta tese, nós quantificamos e atribuímos classificações de localização subcelular a mais de 3000 proteínas. Dentre essas proteínas, 600 tem potencialmente a sua distribuição subcelular alterada em resposta à radiação. As redistribuições subcelulares são acompanhadas de modulações redox, fragmentação mitocondrial e danos no DNA. Na segunda parte da tese, os nossos resultados mostraram que queratinócitos humanos primários entram em senescência sob exposição a uma única dose de radiação UVA, montando respostas antioxidantes e pró-inflamatórias. Células sob senescência induzida por UVA, por sua vez, desencadeiam respostas parácrinas em queratinócitos pré-tumorais (células HaCaT) por meio de mediadores inflamatórios. Em conjunto, esses resultados reiteram o papel da radiação UVA como um potente estressor metabólico em células da pele

Análise proteômica de células BEAS-2B expostas a benzo[α]pireno e nicotinamida ribosídeo / Proteomic Analysis of BEAS-2B cells exposed to benzo[α]pyrene and nicotinamide riboside

Responsável por milhões de óbitos anuais e um grande custo para a saúde pública, o câncer é a segunda maior causa de mortes no mundo. Dentre seus diversos tipos, o câncer de pulmão, além da alta incidência, é um dos mais letais. A exposição a substâncias tóxicas provenientes da combustão de matéria orgânica, assim como o consumo de cigarro, são os principais responsáveis pela alta incidência de câncer de pulmão. Dentre estas substâncias, está o benzo[α]pireno (B[α]P), um carcinógeno completo, ou seja, capaz de iniciar e promover o processo de carcinogênese. Resultados anteriores obtidos pelo grupo demonstraram que células BEAS-2B expostas a 1 µM de B[α]P apresentaram alterações das concentrações de metabólitos intracelulares, indução de estresse redox e hipermetilação do DNA. A exposição a 1 µM de nicotinamida ribosídeo (NR), um dos precursores de NAD+, foi capaz de proteger as células BEAS-2B contra a transformação induzida por B[α]P, além de impedir totalmente que células não expostas a B[α]P formassem colônias em soft-agar. A utilização da proteômica neste trabalho permitiu verificar a abundância das proteínas nos quatro diferentes grupos de exposição: Controle, B[α]P, B[α]P + NR e NR. Após 120 h de exposição as células foram coletadas, as proteínas extraídas e preparadas para análise. Foram descobertas 3024 proteínas posteriormente analisadas com o objetivo de elucidar vias possivelmente envolvidas na proteção contra o processo de transfomação maligna. Os grupos NR e Controle demonstram ser mais parecidos em relação ao seu conteúdo, enquanto os grupos B[α]P e B[α]P + NR foram mais semelhantes entre si. A análise de proteínas exclusivas revelou menos processos relacionados ao reparo de DNA no grupo tratado apenas com B[α]P quando comparado com B[α]P + NR. A análise estatística do total de proteínas utilizando o teste ANOVA (p < 0,05, N = 5) revelou 564 proteínas diferencialmente expressas entre os grupos. A clusterização nos permitiu observar a diferença na abundância de proteínas entre os quatro tratamentos. As proteínas estão envolvidas em funções como a regulação do metabolismo, resposta a estresse, transdução de sinal, regulação de expressão gênica e morte celular. Um dos clusters (cluster 1), contendo 59 proteínas, revelou poucos processos na análise de enriquecimento, mas as proteínas contidas nele apresentam funções como controle da divisão celular, apoptose e proteção ao estresse redox. Nele podemos observar que, no geral, o tratamento com B[α]P aumentou a abundância de algumas proteínas, o que foi revertido no grupo B[α]P + NR. O tratamento apenas com NR diminuiu a abundância das proteínas contidas nesse cluster. Outro cluster (cluster 4) apresentou 51 proteínas de abundância diminuída durante a exposição ao B[α]P, o que se reverteu no grupo B[α]P + NR. As proteínas desse cluster estão envolvidas em etapas importantes da via glicolítica, de crescimento, adesão, migração e invasão celular. Apesar de ser descrito que a exposição a NR pode aumentar a eficiência do reparo de DNA, os resultados apresentados nesse trabalho indicam que o efeito protetor pode estar relacionado com a modulação do ciclo celular ou alterações na adesão celular

Responsible for millions of annual deaths and a great health expense, cancer is the second leading cause of death in the world. Among its many types, lung cancer, besides its high incidence, is also one of the most lethal. Exposure to toxic substances resulting from the combustion of organic matter, as well as cigarette consumption, are the mainly responsible for the high incidence of lung cancer. One of these substances is benzo[α]pyrene (B[α]P), a complete carcinogen, able to initiate and promote the carcinogenesis process. Results obtained previously demonstrated that BEAS-2B cells exposed to 1 µM BaP presented alterations in the levels of intracellular metabolites, induction of oxidative stress, and hypermethylation of DNA. The exposure to 1 µM nicotinamide riboside (NR), one of the precursors of NAD+, was able to protect BEAS-2B cells against the transformation induced by B[α]P, moreover, it also totally prevented the colonies formation on soft agar in cells not exposed to B[α]P. The use of proteomics allowed us to verify the abundance of proteins in the four different exposure groups: Control, B[α]P, B[α]P + NR e NR. After 120h of exposure, the cells were collected followed by the extraction of the proteins. A total of 3024 proteins were identified and analyzed aiming to elucidate possible pathways involved in the protective effect against the malignant transformation induced by B[α]P. The NR and Control groups showed to be more similar, while B[α]P and B[α]P + NR were more similar. The analysis of exclusive proteins revealed fewer processes related to DNA repair in B[α]P when compared with B[α]P + NR. The statistical analysis of the total proteins using the ANOVA test (p <0.5, N = 5) revealed 564 proteins differentially expressed between the groups. The heatmap showed the difference in protein abundance between the four treatments. Proteins are involved in functionssuch asthe regulation of metabolism, stress response, signal transduction, regulation of gene expression, and cell death. One of the clusters (cluster 1), containing 59 proteins, revealed a few processes in the enrichment analysis, but the proteins contained in it have functions such as control of cell division, apoptosis, and protection from redox stress. It is possible to observe, in general, treatment with B[α]P increased the abundance of some proteins, which was partially reversed in group B[α]P + NR. On the other hand, the NR treatment decreased the abundance of proteins contained in this cluster. Another cluster (cluster 4) showed 51 proteins of decreased abundance during exposure to B [α] P, which was partially reversed in group B[α]P + NR. The proteins in this cluster are involved in important stages of the glycolytic pathway, also in growth, adhesion, migration, and cell invasion. Although it has been described that exposure to NR can increase the efficiency of DNA repair, the results presented in this work indicate that the protective effect may be related to the modulation of the cell cycle or cell adehsion modifications

Large-scale plasma proteomics can reveal distinct endotypes in chronic obstructive pulmonary disease and severe asthma.

BACKGROUND: Chronic airway diseases including chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and asthma are heterogenous in nature and endotypes within are underpinned by complex biology. This study aimed to investigate the utility of proteomic profiling of plasma combined with bioinformatic mining, and to define molecular endotypes and expand our knowledge of the underlying biology in chronic respiratory diseases. METHODS: The plasma proteome was evaluated using an aptamer-based affinity proteomics platform (SOMAscan®), representing 1238 proteins in 34 subjects with stable COPD and 51 subjects with stable but severe asthma. For each disease, we evaluated a range of clinical/demographic characteristics including bronchodilator reversibility, blood eosinophilia levels, and smoking history. We applied modified bioinformatic approaches used in the evaluation of RNA transcriptomics. RESULTS: Subjects with COPD and severe asthma were distinguished from each other by 365 different protein abundancies, with differential pathway networks and upstream modulators. Furthermore, molecular endotypes within each disease could be defined. The protein groups that defined these endotypes had both known and novel biology including groups significantly enriched in exosomal markers derived from immune/inflammatory cells. Finally, we observed associations to clinical characteristics that previously have been under-explored. CONCLUSION: This investigational study evaluating the plasma proteome in clinically-phenotyped subjects with chronic airway diseases provides support that such a method can be used to define molecular endotypes and pathobiological mechanisms that underpins these endotypes. It provided new concepts about the complexity of molecular pathways that define these diseases. In the longer term, such information will help to refine treatment options for defined groups.

Medicina de precisión para el diagnóstico de sepsis neonatal: revisión sistemática y metaanálisis / Precision medicine for the diagnosis of neonatal sepsis: systematic review and meta-analysis

ANTECEDENTES: Los biomarcadores actuales para el diagnóstico de sepsis neonatal tienen una exactitud limitada. El desarrollo de la medicina de precisión basada en tecnologías ómicas ofrece una oportunidad para mejorar el diagnóstico de la sepsis neonatal. OBJETIVOS: Evaluar la sensibilidad y especificidad de las pruebas basadas en tecnologías ómicas (metabolómica, proteómica y genómica/transcriptómica) para el diagnóstico de sepsis neonatal. METODOLOGÍA: Se realizó una revisión sistemática en bases de datos electrónicas. Se incluyeron estudios observacionales y ensayos clínicos que evaluaran las pruebas basadas en tecnologías ómicas en neonatos comparado con el cultivo para el diagnóstico de sepsis neonatal. Dos revisores independientes realizaron la evaluación de la calidad de los estudios y la extracción de los datos. Para el metaanálisis se realizó un modelo de efectos aleatorios y se planeó una evaluación de la heterogeneidad a través de un análisis de subgrupos por prueba ómica, edad gestacional y tiempo de establecimiento de la sepsis. RESULTADOS: Se observa expresión diferencial del genoma, proteoma y metaboloma entre los neonatos con y sin sepsis, identificando diferentes biomarcadores. El metaanálisis mostró una medida de resumen combinada para la sensibilidad de 0,88 (IC 95% 0,72-0,96), especificidad de 0,76 (IC 95% 0,62-0,85). CONCLUSIÓN: Las pruebas basadas en ómicas tienen una alta sensibilidad, siendo las de mejor rendimiento las basadas en genómica/transcriptómica. Los estudios tienen alta heterogeneidad.

BACKGROUND: Current biomarkers for the diagnosis of neonatal sepsis llave limited accuracy. The development of precision medicine based on omic's technologies offer an opportunity to improve the diagnosis of neonatal sepsis. AIM: To evalúate the sensitivity and specificity of tests based on omic technologies (metabolomics, proteomics and genomics) for the diagnosis of neonatal sepsis. METHODS: A systematic review was carried out in electronic databases. Observational studies and clinical trials evaluating tests based on omic technologies in neonates compared to culture for the diagnosis of neonatal sepsis were included. For the meta-analysis, a random effects model and an evaluation of heterogeneity were proposed through a subgroup analysis by omic test, gestational age and time of establishment of sepsis. RESULTS: Differential expression of the genome, proteome and metabolome is observed between neonates with and without sepsis, identifying different biomarkers. The meta-analysis showed a pooled summary measure for sensitivity of0.88 (95% CI 0.72, 0.96), specificity of0.76 (95% CI 0.62, 0.85). CONCLUSION: Omics-based tests have a high sensitivity, with the best performing ones being those based on genomics / transcriptomics. The studies have high heterogeneity.